Curso Online de MARCADORES MOLECULARES NA ERA DO GENOMA: METÓDOS E APLICAÇÕES

METODOS E APLICAÇÕES
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Projeto Elaborado por:
Laís Reginy BI Courses

Lista de abreviaturas, siglas, acrônimos e símbolos
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): Ferramenta básica de pesquisa de alinhamento local

BSA (bovine serum albumin): Albumina de soro bovino
CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences): Sequências Polimórficas Amplificadas Alivadas
dCAPS (Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences): Sequências Polimórficas Amplificadas Clivadas Derivadas
CGH (Comparative Genome Hibridization): Hibridização Genômica Comparativa CODIS ( Combined DNA Index System): Sistema combinado de índices de DNA DAPC (Discriminant Analysis of Principal Components): Análise discriminante de componentes principais

DArT (Diversity arrays technology)
ddNTP (dideoxynucleotide): Dideoxinucleotídeos dNTP (deoxynucleotide): Deoxinucleotídeos
DNA (desoxyribonucleic acid): Ácido desoxiribonucleico
DMSO (dimethyl sulfoxide): Sulfóxido de dimetilo ou Dimetilsulfóxido EST ( Exressed Sequence Tags): Sequências Alvos Expressas

GBS (Genotyping by sequencing): Genotipagem por Sequenciamento
InDels (insertion or deletion): Inserções e/ou deleções de uma base ou um segmento de DNA ISSR (Inter-simple sequence repeats): Entre sequências simples repetidas
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry): União Internacional de Química Pura e Aplicada
NGS (Next Generation Sequencing): Sequenciamento de nova geração PCA ( Principal Component Analysis): Análises de componentes principais
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PCR (Polymerase Chain Reaction): Reação em cadeia da polimerase
PIC (Polymorphism Information Content): Conteúdo de informação polimórfica P5CS (Pyrroline-5-carboxylate synthase): Pirrolina-5-carboxilato sintase

QTL (Quantitative Trait Loci): Lócus de Caracteres Quantitativos
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição

RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA): DNA polimórfico amplificado ao acaso
RAD-seq (Restriction-site associated DNA sequencing): Sequenciamento de fragmentos de DNA associados a sítios de restrição
RRLs (Reduced-representation libraries): Bibliotecas de representação reduzida RNA (Ribonucleic acid): Ácido Ribonucleico

RNA-seq (RNA sequencing): Sequenciamento de RNA
RST (Restriction Site Tagged Microarrays): Microarranjo de sítio de restrição marcado sDNA (single-strand DNA): DNA em fita simples
sPCA (spatial Princial Components Analysis): Análise espacial de componentes principais

SSR (Simple Sequence Repeats): Sequências simples repetidas
SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism): Polimorfismos de comprimento de sequências simples

STRs (Short Tandem Repeats): Sequências curtas repetidas em tandem
SNPs ( Single Nucleotide Polymorphism ): Polimorfismo de nucleotídeo único UPOV ( União para Proteção das Obtenções Vegetais)
VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats): Números variáveis de repetições em tandem Kb - Kilo base pb - pares de bases ng - nanogramas

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Símbolos

32P - fósforo radioativo
- Lambda - Phi

-Alfa
µ - micro - Delta

SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 .................................................................................................... 12
Marcadores genéticos baseados em DNA .......................................................... 12
CAPÍTULO 2 .................................................................................................... 21
Genômica e sequenciamento de nova geração ................................................... 21
Considerações gerais ..................................................................................... 21
Os primeiros métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos ..................... 25
Maxam e Gilbert: um método químico de sequenciamento de DNA.............. 26
Um período de novidades e o início dos grandes sequenciamentos de DNA com dideoxinucleotídeos............................................................................................. 26
O sequenciamento de DNA e a detecção do pirofosfato ................................ 30
Sequenciamento por ligação e a tecnologia SOLiD....................................... 33
Amplificação em ponte e o sequenciamento Illumina .................................... 35
Sequenciamento por semicondutores, a tecnologia Ion ................................. 38
Sequenciamento de moléculas únicas e a tecnologia Helicos........................ 40 Pacific Biosciences e o sequenciamento em tempo real de moléculas únicas 41 Nanoporos e sua utilização no sequenciamento de DNA............................... 43
Considerações finais ...................................................................................... 45
CAPÍTULO 3 .................................................................................................... 51
Marcador molecular CAPS - Sequências polimórficas amplificadas clivadas (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)................................................................. 51
Considerações Gerais .................................................................................... 51
Enzimas de restrição ...................................................................................... 53
Metodologia de isolamento/identificação e genotipagem .............................. 54
Métodos utilizados para análise de matrizes de dados .................................. 56 Mapeamento genético e QTLs ........................................................................ 56 Aplicações....................................................................................................... 57
Considerações finais ...................................................................................... 57

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CAPÍTULO 4 .................................................................................................... 60
Marcadores moleculares baseados em restrição: AFLP e suas variações .......... 60
Considerações gerais ..................................................................................... 60
Metodologia de identificação e isolamento .................................................... 61
Genotipagem................................................................................................... 63
Vantagens e Limitações da Técnica de AFLP ................................................ 65
Métodos Utilizados para Análise de Matrizes de Dados e Aplicações .......... 66

Análise da diversidade genética de populações ou espécies ................... 66

Estrutura populacional............................................................................. 67

Relacionamento filogenético interespecífico............................................ 67

Identificação de híbridos .......................................................................... 68
Melhoramento genético e agricultura ...................................................... 69 Aplicações na saúde humana e diagnóstico de doenças .......................... 69 Variações da Técnica de AFLP ...................................................................... 70

CRoPS (Complexity Reduction of Polymorphic Sequences) .................... 70

RAD-seq (Restriction-site associated DNA sequencing).......................... 71

cDNA-AFLP ............................................................................................. 72
Considerações Finais ..................................................................................... 73
CAPÍTULO 5 .................................................................................................... 77
Marcadores moleculares baseados na análise de sequências: utilização em filogenia e filogeografia.................................................................................................. 77
Considerações gerais ..................................................................................... 77
Metodologia de Isolamento ............................................................................ 79
Métodos utilizados para análise de matrizes de dados obtidos por PCR da região de interesse...................................................................................................... 82
Exemplos de aplicações .................................................................................. 85
CAPÍTULO 6 .................................................................................................... 94
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Microssatélites: Metodologias de identificação e análise................................... 94
Considerações gerais ..................................................................................... 94
Metodologia de isolamento/identificação e genotipagem .............................. 96

Metodologias de Isolamento .................................................................... 96

Projeção de primers, otimização da reação de PCR e genotipagem....... 99

Identificação dos alelos.......................................................................... 101
Métodos utilizados para análise de matrizes de dados ................................ 102

Análises de diversidade genética entre populações ou espécies............ 102

Estrutura populacional........................................................................... 103

Identificação de híbridos e estimativas de fluxo gênico......................... 104

Mapeamento genético............................................................................. 105

Análise de parentesco............................................................................. 106

Análises forenses e perfil molecular ...................................................... 106
Aplicações..................................................................................................... 108
Considerações Finais ................................................................................... 113
CAPÍTULO 7 .................................................................................................. 118
DArT: marcadores baseados em Diversity Arrays Technology....................... 118
Considerações gerais ................................................................................... 118
Características da tecnologia DArT ............................................................ 119

Princípios básicos .................................................................................. 119

Comparando DArT com outras tecnologias .......................................... 120
Desenvolvendo marcadores do tipo DArT ................................................... 121

Desenvolvimento dos painéis de diversidade ......................................... 121

Genotipagem das amostras alvo ou targets ........................................... 122

Análises de DArT.................................................................................... 122
Vantagens da tecnologia DArT .................................................................... 124
Aplicações dos marcadores DArT ................................................................ 125
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Estudos de diversidade genética ............................................................ 125

Melhoramento genético vegetal ............................................................. 125
Considerações finais .................................................................................... 127
CAPÍTULO 8 .................................................................................................. 132
Polimorfismo de Nucleotídeo único (SNP): metodologias de identificação, análise e aplicações....................................................................................................... 132
Considerações gerais ................................................................................... 132
Metodologia de Identificação e Genotipagem ............................................. 134 Identificação e genotipagem usando tecnologias baseadas em NGS .......... 135 Métodos utilizados para análise de matrizes de SNPs ................................. 150 Análises de Seleção ...................................................................................... 162
Aplicações..................................................................................................... 163
Exemplos....................................................................................................... 166
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Prefácio
A detecção e a análise de polimorfismos genéticos são de interesse em diversas áreas, pois podem nos auxiliar a compreender a base molecular de vários aspectos biológicos. Marcadores moleculares são definidos como um segmento específico de DNA representativo das diferenças ao nível do genoma que permitem fazer inferências diretas sobre a diversidade genética e inter-relações entre os organismos ao nível do DNA. A publicação de Botstein et al. (1980) sobre a construção de mapas genéticos usando polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) foi a primeira técnica de marcador molecular relatada para a detecção de polimorfismos de DNA. Desde então, diversas técnicas foram desenvolvidas e têm agido como ferramentas versáteis em diversas áreas.
As técnicas para estudos com marcadores moleculares têm sido aprimoradas com os progressos fenomenais das metodologias que permitem a identificação de marcadores em escala genômica, tais como o surgimento de diferentes plataformas de sequenciamento de alto desempenho (hoje denominadas de plataformas de Next Generation Sequencing NGS). Estas técnicas avançadas são uma fusão das características vantajosas de várias técnicas básicas, bem como a incorporação de modificações na metodologia para aumentar a sensibilidade e resolução na identificação e genotipagem. Tais tecnologias, aliadas às análises de bioinformática e estatística, tornaram possível identificar e genotipar diferentes indivíduos em um único passo para alguns tipos de marcadores moleculares.
O crescente avanço das técnicas de marcadores moleculares permitiu a geração de dados que estão disponíveis através de uma vasta literatura em forma de artigos científicos. Na tentativa de demonstrar uma evolução na utilização de marcadores moleculares paralelamente ao surgimento de diferentes metodologias de sequenciamento de alto desempenho, o presente livro traz um histórico sobre marcadores moleculares, inserindo as atualidades sobre as novas metodologias de identificação e genotipagem dos marcadores mais utilizados atualmente em diversas áreas. Esta obra reúne informações detalhadas das metodologias utilizadas para a identificação e genotipagem dos mesmos, métodos de análise e aplicações.
Esse curso oferece uma excelente introdução, visão geral e aplicação dos principais marcadores moleculares para estudantes de graduação, pós-graduação e pesquisadores que tenham interesse mais aprofundado sobre o assunto . As bases técnicas de uma série de
diferentes marcadores moleculares são descritas em detalhe ao longo dos capítulos, o que é de extrema importância no momento da escolha do tipo de marcador e qual o mais apropriado para cada estudo em particular. Além disso, algumas metodologias de análises são descritas para cada marcador focando em diferentes aplicações . Nesta obra foi abordado um passo a passo de como proceder com dados de SNPs oriundos de metodologias que utilizaram plataformas de sequenciamento de alto desempenho.

Boa leitura!
Laís Reginy
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Capítulo 1 Marcadores genéticos baseados em DNA
Dra. Caroline Turchetto, Profª. Dra. Andreia Carina Turchetto-Zolet, Dra. Gisele Passaia, Dra. Camila Martini Zanella

Um marcador genético é qualquer caráter visível ou um fenótipo que de alguma forma seja analisável, para o qual os alelos em loci individuais segregam de uma maneira mendeliana, tais como as características visíveis das ervilhas estudadas por Mendel. Os marcadores genéticos morfológicos foram os primeiros utilizados, e são ainda hoje, a base do melhoramento genético convencional, em que características desejáveis são selecionadas nos genitores para os cruzamentos. Os marcadores genéticos bioquímicos, tais como os terpenos e as isoenzimas, foram marcadores genéticos utilizados antes do surgimento dos marcadores moleculares. Esses marcadores bioquímicos foram aplicados a uma série de estudos. As primeiras moléculas a serem utilizadas como marcadores genéticos bioquímicos foram metabólitos secundários tais como antocianinas e compostos fenólicos, usados para distinguir entre diferentes variedades de plantas (Grover e Sharma, 2014). Marcadores enzimáticos (Alozimas) tiveram grande importância, apesar de apresentarem baixo grau de polimorfismo, tendo sido utilizados por um curto período de tempo, quando passaram a ser substituídos por marcadores de DNA capazes de detectar uma maior variabilidade entre indivíduos.
Polimorfismos de DNA surgem como resultado de uma variação (mutação) e são geralmente referidos pelo tipo de mutação que os criou. O desenvolvimento e uso de marcadores moleculares para a detecção e exploração desses polimorfismos do DNA é um dos avanços mais significativos no campo da genética molecular. Isto se deve ao fato de que a utilização de marcadores localizados no DNA fornece um número praticamente ilimitado de informação distribuídos aleatoriamente ao longo do genoma. Por isso, os marcadores moleculares são altamente valorizados em diversas áreas que envolvem genética, biologia molecular e biotecnologia, tais como genética de populações, filogeografia, filogenia molecular, mapeamento genético, diagnósticos de doenças genéticas, testes de paternidade e para quem investiga as relações entre genótipo e fenótipo.
Com o avanço das técnicas de biologia molecular, a manipulação do DNA em laboratório tornou-se uma técnica recorrente. No início dos anos 1980, o uso de marcadores moleculares passou a integrar rotineiramente a análise do DNA das mais diversas espécies. Desde então, eles vêm sendo aperfeiçoados e evoluindo juntamente com os avaços nas técnicas de sequenciamento em larga escala (Figura 1.1). A presença de vários tipos de marcadores moleculares e diferenças nos seus princípios, metodologias e aplicações requerem uma consideração cuidadosa na escolha de um ou mais desses métodos de acordo com a aplicação, bem como com os recursos (técnico, financeiro, equipamentos) disponíveis em cada centro de pesquisa.
Os marcadores de DNA são divididos em três categorias principais: os baseados
em hibridização, os baseados em PCR (Reação em cadeia da Polimerase Polymerase Chain Reaction) e por fim, marcadores baseados em sequenciamento. Os marcadores também podem ser classificados de acordo com o tipo de herança alélica em dominantes e codominantes. Os marcadores codominantes possibilitam diferenciar indivíduos homozigotos e heterozigotos, o que não é possível com marcadores dominantes, para os

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quais apenas é possível identificar a presença ou ausência de um determinado alelo. Esta característica é bem importante dependendo do objetivo do estudo; por exemplo, não é possível realizar análise de paternidade com marcador dominante.
Figura 1.1 - Estimativa aproximada da popularidade dos marcadores moleculares nos últimos 37 anos. A construção deste gráfico foi baseada em dados obtidos através de buscas sistemáticas na base de dados do Web of Science usando como palavras chave o nome do marcador por extenso, sigla e o ano da publicação. Pesquisa realizada em Abril de 2017.
As técnicas de hibridização e PCR contribuíram para os avanços nos marcadores genéticos de DNA. O sistema de marcador genético baseado em hibridização é embasado na propriedade de pareamento de bases complementares. Este sistema permitiu o desenvolvimento de métodos que utilizam pequenos fragmentos de DNA como sondas para revelar polimorfismos apenas nas sequências homólogas à esta sonda. Um sistema de marcador genético derivado desta abordagem é a técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Botstein et al., 1980) que foi o primeiro marcador genético baseado em DNA desenvolvido. Uma breve descrição do procedimento RFLP é mostrada no Capítulo 3. O polimorfismo deste marcador é baseado nos diferentes tamanhos de fragmentos gerados por enzimas de restrição. Este marcador foi utilizado para a construção do primeiro mapa molecular em humanos em 1980 (Botstein et al., 1980). Por ser codominante e identificar um locus específico, este tipo de marcador é informativo e capaz de discriminar genótipos individuais (Gebhardt et al., 1989). Este marcador foi e ainda hoje é utilizado em diferentes abordagens de estudo, tais como mapeamento genômico em plantas, marcação gênica, dinâmica populacional e relacionamento taxonômico (Figura 1.1), (Bonierbale et al., 1988; Yoshimura et al., 1992; Raybould et al., 1996; Jena e Kochert, 1991; Liu et al., 2016). Além disso, esta técnica foi também utilizada como base para a identificação e

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