Curso Online de Tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração

TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO

Capítulo 1 Complexidade genômica e sequenciamento

Capítulo 2 Primeira geração de sequenciamento

Capítulo 3 Segunda geração de sequenciamento

Capítulo 4 Terceira geração de sequenciamento

Capítulo 5 Aplicação: expressão de SUTs de cana-de-açúcar usando bibliotecas de RNA Seq

Sumário

Introdução

A história do sequenciamento do DNA começa com os trabalhos de cristalografia de raios X de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, decifrados por Francis Crick e James Watson. Crick e Watson propuseram um modelo para a molécula de DNA, recendo um prêmio Nobel pelo feito.

http://www.whatislife.ie/cambridge.htm

https://undsci.berkeley.edu/article/dna_checklist

Nos anos 70, surgem as primeiras técnicas de sequenciamento do DNA, o método de sequenciamento químico de Allan Maxam e Walter Gilbert e o sistema de Alan Coulson e Frederick Sanger.

O método de Maxam e Gilbert utiliza radiação para sequenciar o DNA, ao passo que o método de Sanger utiliza a DNA polimerase. A técnica de terminação de cadeia ou didesoxi de Sanger utiliza ddNTPs, análogos químicos dos desoxirribonucleotídeos (dNTPs), os monômeros das cadeias de DNA, misturando-os em uma reação de PCR.

Com o tempo, outros sistemas foram criados, com o objetivo de sequenciar mais precisamente e genomas cada vez maiores.

Linha do tempo do sequenciamento do DNA

Capítulo 1 Complexidade genômica e sequenciamento

Vinte e um anos após a publicação do primeiro genoma de um ser vivo, a bactéria Haemophilus influenzae, pelo instituto TIGR em 1995 (MICHAEL; JACKSON, 2013), avanços expressivos de sequenciamento e de análise computacional levaram à publicação de milhares de novos genomas, das mais diferentes espécies. A publicação do genoma de Escherichia coli aconteceu em 1997, apenas dois anos depois de H. influenzae (BLATTNER et al., 2010). O genoma de H. influenzae possui aproximadamente 1,8 megabases, sendo o de E. coli três vezes maior do que isso.

Haemophilus influenzae

https://en.wikipedia.org/wiki/Haemophilus_influenzae

https://br.pinterest.com/pin/518758450802181165/

Escherichia coli

A rápida obtenção do genoma de E. coli se deve à técnica de shotgun sequencing, através da qual o DNA é fragmentado em porções randômicas e sequenciado automaticamente, contudo impossibilitando o conhecimento da localização no cromossomo. Através de sobreposição os fragmentos são reagrupados e obtém-se a sequência completa por meio de análise computacional (STADEN, 1979).

https://slideplayer.com.br/slide/288979/

Essa técnica permitiu a execução de inúmeros projetos de genomas de organismos procarióticos, possibilitando, também, avanços na direção do sequenciamento de genomas eucarióticos, obviamente mais complexos, podendo possuir múltiplas cópias, além de genes caracterizados pela presença de íntrons e regiões altamente repetitivas.

O sequenciamento completo do cromossomo III de Saccharomyces cerevisae, em 1992 (OLIVER et al., 1992), representou um importante passo na compreensão da biologia molecular de genomas eucarióticos, mais simples de estudar do que de mamíferos ou outros eucariotos superiores. Além de Saccharomyces, três outros organismos participaram decisivamente da evolução da genômica: Caenorhabditis elegans, sequenciado em 1998, 100 milhões de bases; Arabidopsis thaliana, sequenciado em 2000, 119 milhões de bases e Drosophila melanogaster, sequenciado em 2000, 165 milhões de bases.

Devido às tecnologias de nova geração, observamos o sequenciamento de genomas cada vez mais complexos e em menor intervalo de tempo do que nos trabalhos iniciais.

Os avanços das técnicas de sequenciamento foram especialmente impulsionados pelo bem sucedido Projeto Genoma Humano, que ajudou na adequação das técnicas a genomas maiores e mais complexos, culminando com a diminuição dos custos de sequenciamento em mais de 10.000 vezes em pouco mais de uma década (FEUILLET et al., 2011).

Adequação das técnicas a genomas mais complexos é essencial, por exemplo, para o sequenciamento de genomas de plantas, especialmente mais difíceis de sequenciar pela presença de várias classes de DNA repetitivo em centenas ou milhares de cópias intercalando as sequências codificantes (SCHMIDT; HESLOP-HARRISON, 1998).

Além disso, a poliploidia também contribui para a complexidade do genoma e as dificuldades de seu sequenciamento completo. Um evento comum em plantas, a duplicação genômica, cria altos níveis de redundância, afetando negativamente a precisão da montagem do genoma (WANG et al., 2012).

https://sites.google.com/site/botany315/plants-structure/8---propogation-biotechnology?tmpl=%2Fsystem%2Fapp%2Ftemplates%2Fprint%2F&showPrintDialog=1

Exemplos de plantas poliplóides.

De acordo com a ordem de aparecimento, as tecnologias de sequenciamento são divididas em gerações: primeira, segunda e terceira. Além disso, cada plataforma possui suas vantagens e desvantagens.